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復(fù)雜注射劑之脂質(zhì)體的表征與解決方案

 更新時(shí)間:2023-04-11  點(diǎn)擊量:1534

復(fù)雜注射劑之脂質(zhì)體的表征與解決方案

脂質(zhì)體粒徑控制的重要性

納米脂質(zhì)體 (nanoliposomes) 是一種具有類細(xì)胞膜磷脂雙分子層的納米囊泡體,因?yàn)榱字瑢优c細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)類似,可以與細(xì)胞膜融合,從而將藥物送入細(xì)胞核中。脂質(zhì)體載體的釋藥機(jī)制,使其不但可以增加藥物溶解度,還具有潛在的緩釋或靶向特性,廣受研發(fā)人員的青睞,全球范圍內(nèi)已有 10 余種注射用脂質(zhì)體產(chǎn)品獲批上市。

納米藥物與其他藥物一樣,必須具有安全性、可控性與有效性,有效性是納米藥物實(shí)現(xiàn)疾病治療的基礎(chǔ)。脂質(zhì)納米注射劑經(jīng)給藥在體內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí),需要克服多重生理/病理屏障,才能安全到達(dá)靶點(diǎn)發(fā)揮治療作用,在發(fā)揮其藥效前需要克服血液、組織、細(xì)胞和細(xì)胞器等多重屏障。[1]通過調(diào)控納米藥物本身的物理化學(xué)性質(zhì),如納米藥物的大小、形狀、表面電荷等,一定程度上能夠克服藥物遞送障礙[2]

相比于傳統(tǒng)注射劑,脂質(zhì)體具有靶向作用,可減輕藥物的毒副作用,機(jī)體器官對(duì)不同粒徑微粒的阻留能力不同,可通過脂質(zhì)體注射劑的粒徑控制實(shí)現(xiàn)藥物被動(dòng)靶向效果。[3]脂質(zhì)體粒徑小于50nm時(shí)一般都能夠靶向至脾組織;在50~100nm時(shí)能靶向至肝組織;在0.1~0.2μm時(shí)能夠靶向至肝組織肝巨噬細(xì)胞的溶酶體;在7~12μm時(shí)可被肺組織細(xì)胞攝??;>12μm時(shí)能夠被毛細(xì)血管上皮細(xì)胞攝取進(jìn)而到達(dá)荷瘤組織內(nèi);>15μm時(shí)能被腸系膜動(dòng)脈等血管上皮細(xì)胞攝取[4]。

脂質(zhì)體的粒徑直接影響藥物的釋放、生物利用度、載藥量、靶向性等,在制備時(shí)應(yīng)控制粒子的大小,獲得較窄且均勻的粒度分布。


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奧法美嘉平臺(tái)提供整套的脂質(zhì)體的表征及 解決方案,可用于快速評(píng)估、優(yōu)化脂質(zhì)體的配 方和工藝:PSI高壓微射流均質(zhì)機(jī)對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行 制備和粒徑控制、Nicomp粒度分析儀分析平均 粒徑及Zeta電位的檢測(cè)、AccuSizer顆粒計(jì)數(shù)器 分析大粒子濃度,Lumispoc顆粒計(jì)數(shù)器分析小粒子濃度、Lum穩(wěn)定性分析儀快速分析脂質(zhì)體的 穩(wěn)定性,Entegris-ANOW濾芯過濾雜質(zhì)及大顆粒。                    


   


   

脂質(zhì)體制備流程概述

在脂質(zhì)體的制備方法中有多種制備方法,傳統(tǒng)的方法如:薄膜水化法、溶劑注入法、逆向蒸發(fā)法等。這些方法幾乎都是先將脂質(zhì)溶解在有機(jī)溶劑中,然后再去除有機(jī)溶劑。另外,也有大量的非傳統(tǒng)制備方法用于研究,如超臨界流體(supercritical fluid, SCF)、微流體技術(shù)、冷凍干燥法。此處,介紹一種脂質(zhì)體的制備流程,見圖1,通過傳統(tǒng)方法制備粒徑比較大的粗脂質(zhì)體,在除去有機(jī)溶劑后,再通過微射流均質(zhì)的方式進(jìn)一步降低粒徑及進(jìn)行整粒;而后通過超濾進(jìn)行純化,得到粒徑均一、滿足使用安全要求的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體的平均粒徑和粒度分布是脂質(zhì)體藥品關(guān)鍵質(zhì)量特性,顯著影響其體內(nèi)行為。溶解磷脂可能需要用到毒性比較大的有機(jī)溶劑,溶劑殘留需要符合ICH相關(guān)規(guī)定,除去可能存在困難。超濾是影響粒徑和溶劑殘留的關(guān)鍵工藝,也是達(dá)到控制的最后一步工藝。[5]


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第1頁(yè)-1.PNG圖1 脂質(zhì)體制備與表征流程圖



脂質(zhì)體粒度控制

脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)屬于非均相熱力學(xué)不穩(wěn)定系統(tǒng),脂質(zhì)體在制備過程中,若粒徑大小及分布不合格,則會(huì)影響產(chǎn)品 后續(xù)質(zhì)量問題。粗脂質(zhì)粒需要經(jīng)過高壓均質(zhì)或微射流進(jìn)行整粒,而后進(jìn)行超濾純化,得到粒徑均一的脂質(zhì)體。高壓微 射流均質(zhì)機(jī)具有大規(guī)模、連續(xù)化生產(chǎn)等特點(diǎn),通過高速撞擊、剪切與空穴作用達(dá)到均質(zhì)與細(xì)化的目的,現(xiàn)已有用于制 備阿糖苷、中鏈脂肪酸、茶多酚及維生素C等納米脂質(zhì)體的實(shí)例。[6]


高壓微射流均質(zhì)機(jī)

                               

PSI-20高壓微射流均質(zhì)機(jī)(小試兼中試型)采用固定 結(jié)構(gòu)的均質(zhì)腔,通過電液傳動(dòng)的增壓器使物料在高壓作 用下以極大的速度流經(jīng)交互容腔的微管通道,物料流在 此過程中受到高剪切力、高碰撞力、空穴效應(yīng)等物理作 用,使得平均粒徑降低、體系均一穩(wěn)定,由此獲得理想 的均質(zhì)、分散、去團(tuán)聚的結(jié)果。                    

                   

最高2069 bar的均質(zhì)壓力,最高處理量20L/h PSI- 20)         

采用特殊設(shè)計(jì)Y型腔,去除尾端大顆粒效果佳,物料 的混合更均一,處理效率高。                      

屏顯界面,數(shù)據(jù)可溯源:支持?jǐn)?shù)據(jù)導(dǎo)出設(shè)定壓力及實(shí) 時(shí)壓力、監(jiān)測(cè)點(diǎn)溫度、實(shí)時(shí)流量、時(shí)間等。                      

配置K型熱電偶:可用于實(shí)施監(jiān)測(cè)料液溫度。                    

低噪音:運(yùn)行音量低于70分貝,工作環(huán)境友好型。                

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平均粒徑與Zeta電位檢測(cè)

脂質(zhì)體理化性質(zhì)評(píng)價(jià)通常包括粒徑大小及分布均勻程度、穩(wěn)定性及包封率等方面。粒徑大小及分布除與其包封率及穩(wěn)定性有關(guān)外,同時(shí)對(duì)載藥脂質(zhì)體的治療效果有直接的影響。因物理和生理作用,機(jī)體能夠選擇性地在肝、脾、肺、淋巴等部位聚集不同大小的載藥脂質(zhì)體,從而使其釋放藥物發(fā)揮藥效。[7]此外,還可以通過檢測(cè)Zeta電位對(duì)脂質(zhì)體穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià),Zeta電位越高,體系更加穩(wěn)定。


                   

Nicomp納米激光粒度儀系列
                   

Nicomp系列納米激光粒度儀采用動(dòng)態(tài)光散射原理檢測(cè)分析樣品的粒度分布,基于多普勒電泳光散射原理檢測(cè)ZETA電位。   

                 

l  粒徑檢測(cè)范圍0.3nm-10μm,ZETA電位檢測(cè)范圍為+/-500mV    

l  搭載Nicomp多峰算法,可以實(shí)時(shí)切換成多峰分布觀察各部分的粒徑。                    

l  高分辨率的納米檢測(cè),Nicomp納米激光粒度儀對(duì)于小于10nm的粒子仍然現(xiàn)實(shí)較好的分辨率和準(zhǔn)確度。
                   

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第3頁(yè)-7.PNG          2∶高斯粒徑分布圖          

第3頁(yè)-6.PNG3Nicomp多峰粒徑分布圖                    


NICOMP3000系列用于脂質(zhì)體粒徑檢測(cè)案例

采用GMV(giant multilamellar vesicle)Sugar-doped lipidfilm hydration(脂膜水化反法)方式制備脂質(zhì)體,對(duì)過濾 擠出工藝前后樣本脂質(zhì)體用Nicomp 3000設(shè)備進(jìn)行粒度檢 測(cè),測(cè)試結(jié)果如表1所示。


Before Extrusion                  After Extrusion through 0.4μm Filter  (3 times)                

第4頁(yè)-11.PNG                    

第4頁(yè)-10.PNG                    

After Extrusion through 0.2μm Filter (3 times)                After Extrusion through 0.1μm Filter  (3 times)                  

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表1 GMV法制備脂質(zhì)體過濾前后粒徑分布圖(Gaussian 分布)


由表1可知,沒有過濾擠出前Gaussian分布下平均體積徑為1237nm;經(jīng)過0.4μm、0.2μm、0.1μm過濾器過濾擠出3次后,平均體積徑為219nm、161nm、101nm;平均粒徑明顯降低。其Nicomp 分布如表2所示。通過Nicomp分布可真實(shí)反映脂質(zhì)體粒徑分布情況,由表2中可知,未擠出脂質(zhì)體體積粒徑Nicomp分布有三個(gè)峰;經(jīng)過0.4μm過濾器擠出后三個(gè)峰的粒徑均減小,經(jīng)過0.2μm過濾器過濾之后變?yōu)閱畏澹?jīng)過0.1μm過濾器過濾之后獲得分布更加窄的單峰。


Before Extrusion                    

After Extrusion through 0.4μm Filter (3 times)                
圖片                圖片                
After Extrusion through 0.2μm Filter (3 times)                After Extrusion through 0.1μm Filter (3 times)                
圖片                圖片                

表2 GMV法制備脂質(zhì)體過濾前后粒徑分布圖(Nicomp 分布)


對(duì)比Gaussian及Nicomp分布結(jié)果可知:Gaussian分布可整體反應(yīng)脂質(zhì)體粒徑分布情況;而Nicomp分布更真實(shí)反映脂質(zhì)體粒徑分布。通過Nicomp數(shù)據(jù)的分析可以更好的幫助脂質(zhì)體制備工藝的優(yōu)化,選擇合適的處理方式得到想要的粒徑范圍樣本。


尾端大顆粒和小粒子的檢測(cè)

用作載藥功能的脂質(zhì)體平均粒徑一般為亞微米級(jí)別或納米級(jí)別,但仍存在微米級(jí)別的脂質(zhì)體粒子,尾端大顆粒的存在往往會(huì)吸附小顆粒,影響脂質(zhì)體的穩(wěn)定性,分析尾端大粒子濃度和數(shù)量可以評(píng)價(jià)當(dāng)前配方和工藝的情況并做出相應(yīng)優(yōu)化,例如用作佐劑的脂質(zhì)體一般檢測(cè)0.8μm~10μm之間的大顆粒分布,以確保工藝的穩(wěn)定。為確保納米藥物的有效性,還需控制小粒子的濃度,過小的脂質(zhì)體粒子容易被腎臟清除到尿液排出,無法起到治療作用。[8]


           

AccuSizer顆粒計(jì)數(shù)器系列     


AccuSizer系列在檢測(cè)液體中顆粒數(shù)量的同時(shí)精確檢測(cè)顆粒的粒度及粒度分布,通過搭配不同傳感器、進(jìn)樣器,適配不同的樣本的測(cè)試需求,能快速而準(zhǔn)確地測(cè)量顆粒粒徑以及顆粒數(shù)量/濃度。                     

                   

l  檢測(cè)范圍為0.5μm-400μm(可將下限拓展至0.15μm)。                    

l  0.01μm的超高分辨率,AccuSizer系列具有1024個(gè)數(shù)據(jù)通道,能反映復(fù)雜樣品的細(xì)微差異,為研發(fā)及品控保駕護(hù)航。                    

l  靈敏度高達(dá)10PPT級(jí)別,即使只有微量的顆粒通過傳感器,也可以精準(zhǔn)檢測(cè)出來。                    

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AccuSizer系列用于脂質(zhì)體粒徑檢測(cè)案例  

采用GMV(giant multilamellar vesicle)Sugar-doped lipid-film hydration(脂膜水化反法)方式制備脂質(zhì)體,對(duì)過濾擠出 工藝前后樣本脂質(zhì)體用AccuSizer A7000設(shè)備進(jìn)行粒度檢測(cè),測(cè)試結(jié)果如表3所示。


After Centrifugation                After Extrusion through 10.0μm Filter (1 time)                

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第6頁(yè)-15.PNG                    

After Extrusion through 5.0μm Filter (1 time)                After Extrusion through 3.0μm Filter (1 time)                

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第6頁(yè)-13.PNG                    

表3 GMV法制備脂質(zhì)體過濾擠出后粒徑分布圖


由表3可知,上面藍(lán)色譜圖為數(shù)量粒徑分布結(jié)果,下面紅色譜圖為體積粒徑分布測(cè)試結(jié)果。分別對(duì)制備的脂質(zhì)體樣品用 10μm、5μm、3μm過濾器過濾,經(jīng)過10μm5μm、3μm過濾器的數(shù)量粒徑分布比未過濾前濃度更低,但數(shù)量粒徑分布 差異不大;觀察體積粒徑分布,可知:經(jīng)過10μm5μm過濾器過濾后,體積占比中大于等于10μm顆粒明顯減少;經(jīng)過 3μm過濾器過濾后,10μm顆粒體積占比進(jìn)一步減少,且主峰已不在10μm處,尾端大顆粒明顯減少。

穩(wěn)定性分析檢測(cè)  

穩(wěn)定性是評(píng)估藥物的常規(guī)項(xiàng),脂質(zhì)體穩(wěn)定性影響存放時(shí)間和有效期,穩(wěn)定性較差的脂質(zhì)體會(huì)導(dǎo)致藥物療效降低或副作用增加,有的藥物甚至產(chǎn)生有毒物質(zhì)??刂莆捕舜罅W訑?shù)量和濃度能有效提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性,此外,粒徑分布較窄的脂質(zhì)體穩(wěn)定性也較好。


LUM穩(wěn)定性分析儀    

                

LumiFuge穩(wěn)定性分析儀可以直接測(cè)量整個(gè)樣品的分散體的穩(wěn)定性,檢測(cè)和區(qū)分各種不穩(wěn)定現(xiàn)象,如上浮、絮凝、聚集、聚結(jié)、沉降等,通過測(cè)量結(jié)果可用來開發(fā)新的配方和優(yōu)化現(xiàn)有的配方及工藝


l  快速、直接測(cè)試穩(wěn)定性,無需稀釋,溫度范圍寬廣 

l  可同時(shí)測(cè)8個(gè)樣品,測(cè)量及辨別不同的不穩(wěn)定現(xiàn)象及不穩(wěn)定性指數(shù)

l  加速離心,最高等效2300倍重力加速度                     

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過濾

粗脂質(zhì)體經(jīng)高壓微射流等設(shè)備整粒之后,需經(jīng)過超濾才能得到最終的脂質(zhì)體成品。超濾是以壓力為推動(dòng)力的膜分離技術(shù)之一,優(yōu)點(diǎn)是沒有相轉(zhuǎn)移,無需添加任何強(qiáng)烈化學(xué)物質(zhì),可以在低溫下操作,過濾速率較快,便于做無菌處理等。超濾技術(shù)的關(guān)鍵是濾膜,濾膜有各種不同的類型和規(guī)格,綜合考量物理攔截,吸附攔截等效果,選擇適配的濾膜材質(zhì)用于過濾。


Entegris濾芯     

               

Entegris-Anow是一家高分子微孔膜過濾企業(yè),專業(yè)從事MCENylon、PESPVDF、PTFE等(膜孔徑為0.03μm~10μm)微孔膜的研發(fā)及生產(chǎn),具有二十多年服務(wù)與醫(yī)藥客戶經(jīng)驗(yàn),并為全球生物制藥、醫(yī)療器械、食品飲料、實(shí)驗(yàn)室分析、微電子及工業(yè)等領(lǐng)域的客戶提供過濾、分離和凈化解決方案。                     

                   

EntegrisAnow的結(jié)合,引 入Entegris質(zhì)量管理體系,每一支濾芯都經(jīng)過嚴(yán)格檢查,此外,新建成的CTC驗(yàn)證中心,為全球客戶提供專業(yè)的驗(yàn)證服務(wù)。                    

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參考資料:  

[1] 張燦.聚焦納米治療藥物的成藥性[J].藥學(xué)進(jìn)展,2018,42(11):801-803

[2] 王宇馨. 磷酸錳礦化納米藥物及其抑癌作用研究[D].浙江理工大學(xué),2022.

[3] 高諧,丁楊,周建平.脂質(zhì)納米注射劑的研究與應(yīng)用前景[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志,2019,50(10):1098-1112.

[4] 王富喜,鄧宏圖,王濱.靶向脂質(zhì)體的藥理學(xué)評(píng)價(jià)[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2023,39(01):137-140.

[5] 脂質(zhì)體關(guān)鍵工藝之?dāng)D出和超濾

[6] 陳瓊玲,劉紅芝,劉麗,王強(qiáng).高壓微射流法制備白藜蘆醇納米脂質(zhì)體[J].核農(nóng)學(xué)報(bào),2015,29(05):916-924.

[7] 王富喜,鄧宏圖,王濱.靶向脂質(zhì)體的藥理學(xué)評(píng)價(jià)[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2023,39(01):137-140.

[8] Fukumura D, Kloepper J, Amoozgar Z, et al. Enhancing cancer immunotherapy using antiangiogenics: opportunities and  challenges[J]. Nature Reviews Clinical Oncology, 2018, 15(5):325-340